洽商概述裸舞

2025年3月26日，上海科技大学基因剪辑中心的陈佳提醒团队在Nature Biotechnology期刊发表标题为“Specific and efficient RNA A-to-I editing through cleavage of an ADAR inhibitor”的洽商论文。该洽商主要开发了一种名为RtABE（RNA transformer adenosine base editor）的新式RNA剪辑系统，通过引入ADAR扼制剂（ADI）来扼制ADAR2脱氨酶的活性，从而完了高效且特异性的RNA A-to-I剪辑，并在Hurler概括征小鼠模子中到手矫正了α-l-iduronidase活性残障，且未检测到权臣的非靶向剪辑。

导读

与基因组剪辑不同，RNA剪辑不会引起基因组DNA的长久性变化，因此不错当作一种有出路的颐养技能。迄今为止，东谈主们依然开发出两种主要政策来诱导靶向的腺苷到肌苷（A-to-I）RNA剪辑。在一种政策中，运用工程化的RNA招募内源性RNA腺苷脱氨酶（ADAR），在靶位点介导A-to-I剪辑。这种政策已被解说不错在内源性ADAR偏好的序列环境中（举例UAN、CAG、CAA和AAG）诱导高效的剪辑。在另一种政策中，通过异位抒发工程化的剪辑酶（举例将ADAR2脱氨域（ADAR2DD）与RNA伙同卵白会通，如λ噬菌体对抗绝卵白N（λN）、DNA开垦卵白O6-烷基鸟嘌呤-DNA烷基出动酶（SNAP）的突变体、噬菌体MS2外壳卵白（MCP）和dCas13），运用诱导RNA（gRNA）招募RNA伙同卵白来介导靶向剪辑。但是，运用异位抒发工程化剪辑酶的政策被发现会触发多数的转录组范围的非靶向剪辑，从而适度了其庸碌应用，相配是在疾病颐养方面。

近期，作家识别了脱氧胞嘧啶脱氨酶扼制剂（dCDI）卵白结构域，并运用它们摒除了DNA碱基剪辑器中脱氧胞嘧啶脱氨酶触发的非靶向突变。在本洽商中，作家筛选了可能对ADAR2DD具有扼制作用的卵白结构域，并决然出某些腺苷脱氨酶扼制剂（ADIs）。运用ADI，作家开发了一种具有高特异性和高服从的RNA改换腺苷碱基剪辑器（RtABE）。

RtABE在推广的剪辑范围内（举例UAN、AAN、CAN和GAN）诱导了高效的A-to-I RNA剪辑。在RtABE责罚的细胞中，非靶向剪辑水平接近布景水平。此外，RtABE被包装到单个腺有关病毒（AAV）中，并在Hurler概括征（黏多糖贮积症I型）模子小鼠的肝脏中诱导了权臣的RNA校正。此外，在RtABE责罚的小鼠肝脏中未检测到权臣的非靶向剪辑。因此，RtABE是一种具有庸碌剪辑范围的特异性和高效RNA剪辑系统，可用于基础洽商和疾病颐养。

洽商收尾

1. 决然ADI

本洽商旨在寻找扼制MCP–ADAR2DD(E488Q)脱靶剪辑的腺苷脱氨酶扼制剂（ADI）。作家将mA3CDA2、SIV_Vif和ADAR3等潜在扼制卵白分裂会通到MCP–ADAR2DD(E488Q)的C结尾（图1a），并检测其在六个靶点上的剪辑服从扼制收尾（图1b）。收尾清楚，mA3CDA2和SIV_Vif权臣扼制了剪辑服从（图1c），且这种扼制并非由于会通卵白的降解。

图1. 决然ADAR2DD的扼制剂以减少转录组范围的非靶向剪辑。

进一步洽商发现，东谈主类APOBEC3s（hA3s）的调控结构域也能扼制MCP–ADAR2DD(E488Q)的活性，其中hA3D的调控结构域（hA3DCDA1）收尾最为权臣（图1f）。全转录组测序标明，hA3DCDA1会通能有用裁减全转录组范围的A-to-I脱靶剪辑水平（图1g、h）。因此，作家选用hA3DCDA1当作ADI，并定名为A3DADI，用于后续洽商。

图1. 决然ADAR2DD的扼制剂以减少转录组范围的非靶向剪辑。

2. 非靶向剪辑分析

作家发现，MCP–ADAR2DD(E488Q) RNA剪辑系统激发了庸碌的非靶向剪辑。于是作家将ADAR2DD(E488Q)单独转染到293FT细胞中，收尾清楚其激发的转录组范围的A到I剪辑水平略高于未转染对照组（图2b）。但是，当MCP与ADAR2DD(E488Q)伙同时，即使莫得相应的agRNA，也会激发更高水平的非靶向剪辑（图2b）。此外，将MCP会通到ADAR2DD(E488Q)的C结尾雷同激发了高水平的转录组范围的A到I剪辑（图2b）。这些收尾标明，MCP与非靶向RNA的就地伙同可能是MCP–ADAR2DD(E488Q) RNA剪辑系统在某些非靶向位点激发非靶向剪辑的原因。

图2. 非靶向剪辑在ADAR2DD伙同位点和MCP伙同位点被诱导发生。

为了寻找幸免非靶向剪辑的依次，作家尝试将不同的RNA伙同卵白会通到ADAR2DD上。收尾发现，某些RNA伙同卵白（如dRanCas13b）会通明靶向剪辑服从较低，而另一些（如λN）会通明自然靶向剪辑服从较高，但非靶向剪辑水平也较高，且无法通过A3DADI会通有用扼制。比拟之下，MCP可能是一个符合的RNA伙同域，因为将MCP会通到ADAR2DD上不错诱导高水平的靶向剪辑（图1b），而且其非靶向剪辑不错被A3DADI有用扼制（图1g，h）。

进一步分析发现，MCP–ADAR2DD(E488Q) RNA剪辑系统激发的高水平转录组范围的非靶向剪辑也不错部分归因于其改善的卵白矜重性。WB收尾清楚，MCP–ADAR2DD(E488Q)的卵白抒发水平高于单独的ADAR2DD(E488Q)。非靶向剪辑位点不错分为ADAR2DD依赖和MCP依赖两类。分析清楚，一些位点在仅用ADAR2DD(E488Q)责罚的样本中被剪辑，被称为ADAR2DD依赖的非靶向位点（图2c）；而另一些位点仅在MCP–ADAR2DD(E488Q)责罚的样本中被剪辑裸舞，被称为MCP依赖的非靶向位点（图2c）。

图2. 非靶向剪辑在ADAR2DD伙同位点和MCP伙同位点被诱导发生。

深度测序收尾清楚，ADAR2DD(E488Q)和含有MCP的会通卵白（如MCP–ADAR2DD(E488Q)和ADAR2DD(E488Q)–MCP）在ADAR2DD依赖和MCP依赖的非靶向位点上均激发了不同进程的剪辑（图2d）。这些收尾标明，ADAR2DD依赖的非靶向位点的非靶向剪辑不错由多样含有ADAR2DD(E488Q)的卵白激发（图2e），而且将MCP会通到ADAR2DD(E488Q)上也会导致在MCP依赖的非靶向位点处的非靶向剪辑（图2e），此外还进步了卵白矜重性。

3. RtABE的开发与优化

作家旨在开发一种高效的RNA碱基剪辑器（RtABE），通过引入分裂的香烟蚀刻病毒卵白酶（TEVp）来减少非靶向RNA剪辑，同期保捏靶向剪辑服从。洽商发现，在MCP–ADAR2DD(E488Q)和A3DADI之间插入TEVp切割位点（TS），并通过共抒发λN–TEVc–2A–TEVn版块的分裂TEVp，不错有用裁减非靶向剪辑水平（图3a、c、d）。

图3. 工程化改造TEVp和agRNA以减少非靶向剪辑并进步靶向剪辑服从。

但是，这种分裂TEVp的共抒发导致靶向剪辑服从下落（图3b）。为了进步靶向位点的切割服从，作家进一步瞎想了增强型agRNA（eagRNA），通过添加BoxB aptamers招募λN会通的分裂TEVp。其中，eagRNA_V5版块在靶向位点进展出最高的剪辑服从，同期保捏低水平的非靶向剪辑（图3e、f、g、h、i）。

图3. 工程化改造TEVp和agRNA以减少非靶向剪辑并进步靶向剪辑服从。

在此基础上，作家开发了低级版块的RtABE，通过共抒发MCP–ADAR2DD(E488Q)–TS–A3DADI、eagRNA_V5和λN–TEVc–2A–TEVn完了（图4a）。尽管该版块在两种类型的非靶向位点诱导了低水平的非靶向剪辑，但仍有立异空间。

为进一步进步剪辑特异性，作家凭证ADAR2DD与双链RNA底物相互作用的结构信息，在ADAR2DD的要害位置引入氨基酸替换。历程筛选，发现含有K475Q/E488Q或K475I/S486A突变的RtABE版块在靶向与非靶向剪辑比率上进展最好（图4b、c、d、e、f）。最终，这两种优化后的RtABE版天职别被定名为RtABE_V1和RtABE_V2（图5a），它们在保捏高效靶向剪辑的同期，权臣裁减了非靶向剪辑水平，为RNA剪辑时间的发展提供了新的想路和用具。

图4. 基于结构的ADAR2DD工程化改造以最小化非靶向剪辑。

4. RtABE的特质分析与其他剪辑器的对比

作家使用RtABE_V1和RtABE_V2（图5a）在18个靶向位点诱导A到I剪辑，包括11个UAN序列布景（ADARs偏好靶向位点）和10个VAN序列布景的靶向位点（图5b）。收尾清楚，RtABEs在总共靶向位点均诱导了光显的A到I剪辑，且RtABE_V1的剪辑服从常常高于RtABE_V2（图5b）。

全转录组测序标明，两种版块的RtABEs保捏了低水平的转录组范围非靶向剪辑，RtABE_V2的非靶向剪辑水平更低（图5c）。此外，RtABEs的非靶向剪辑位点数目权臣减少，RtABE_V2进一步将非靶向剪辑位点减少到约50个（主要蚁集在CDS和UTR区域）。这些非靶向位点未能与eagRNA的反义区域酿成矜重双链，标明其非靶向剪辑不太依赖于序列特异性。

图5. 将RtABE与其他RNA碱基剪辑系统进行比较。

作家还分析了RtABEs在不同细胞系中的进展。在HeLa和U2OS细胞中，RtABE_V1和RtABE_V2在四个靶向位点进展出高效的剪辑才略（图5f），且未权臣改变转录组范围的基因抒发水平。此外，RtABEs在招募内源性ADARs的RNA剪辑系统中进展出色，相配是在293FT细胞中，RtABEs（尤其是RtABE_V2）的非靶向剪辑水平接近自然RNA A到I剪辑水平（图5e）。比拟之下，异位抒发工程化ADARs的剪辑器常常会激发更高水平的非靶向剪辑。

图5. 将RtABE与其他RNA碱基剪辑系统进行比较。

为了进一步优化剪辑服从，作家瞎想了不同AS区域长度的eagRNAs，并发现当靶向A位于AS区域中间时，剪辑服从最高。此外，通过删除与旁不雅者腺苷相对的碱基，不错将旁不雅者剪辑裁减到布景水平。在与其他RNA剪辑系统（如dRanCas13b–ADAR2DD(E488Q)、cadRNA和CLUSTER）的对比中，RtABE_V1和RtABE_V2在多种细胞系中均进展出更高的剪辑服从（图5f），即使在ADAR1缺失的细胞系中，RtABEs仍能高效诱导A到I剪辑。这些收尾标明，RtABEs在保捏高效靶向剪辑的同期，权臣裁减了非靶向剪辑水平，具有庸碌的适用性和优胜的剪辑特质。

5. RtABE的体内剪辑执行

作家将RtABE应用于体内RNA剪辑，以颐养Hurler概括征为洽商布景。他们瞎想了一种针对小鼠Idua基因中W392X突变的eagRNA，该突变导致α-L-艾杜糖苷酶（IDUA）浮泛，模拟东谈主类Hurler概括征。

为了测试RtABE在RNA水平上矫正该突变的服从，作家率先在小鼠细胞模子（IDUA–W392X）中考据了RtABE_V1和RtABE_V2的剪辑才略，发现两者均能有用介导剪辑，并规复IDUA活性（图6a）。

随后，作家将RtABE_V2与eagRNA包装到AAV8载体中（图6a），并与针对交流突变的MCP–ADAR2DD(E488Q) RNA剪辑系统进行对比。两种AAV载体以两种滴度（1×10¹²和3×10¹² vg）通过尾静脉打针到Hurler概括征模子小鼠体内。收尾清楚，采纳高滴度MCP–ADAR2DD(E488Q) AAV打针的小鼠在打针后3至4周内示寂，而采纳RtABE_V2或其他责罚的小鼠均存活（图6b）。

图6. RtABE在Hurler概括征小鼠的肝脏中诱导了高效且特异性的RNA矫正。

在肝脏样本中，采纳低滴度MCP–ADAR2DD(E488Q) AAV或任何滴度RtABE_V2 AAV责罚的小鼠均检测到了靶向W392X突变位点的A到I剪辑（图6c）。其中，采纳高滴度RtABE_V2 AAV打针的小鼠肝脏中，打针后4周平均RNA矫正率为27%（范围11%至45%），打针后8周平均RNA矫正率为18%（范围18%至19%）（图6c）。比拟之下，MCP–ADAR2DD(E488Q)即使在低滴度下也激发了权臣的转录组范围非靶向剪辑，而RtABE_V2在职何滴度或时辰点后均未激发权臣的非靶向剪辑（图6f、g）。

此外，RtABE_V2未激发可检测的旁不雅者剪辑，也未权臣改变mIdua转录本的抒发（图6d、e）。在颐养收尾方面，RtABE_V2介导的RNA剪辑权臣规复了IDUA活性，并裁减了糖胺聚糖（GAG）浓度（图6h、i），显败露细腻的颐养后劲。

图6. RtABE在Hurler概括征小鼠的肝脏中诱导了高效且特异性的RNA矫正。

计算

RNA剪辑能够诱导转录本的瞬时变化，是一种极具后劲的疾病颐养政策。但是，现在通过异位抒发工程化ADARs的RNA剪辑用具常常会激发非靶向剪辑。本洽商开发了一种新的RNA碱基剪辑系统RtABE，能够完了特异且高效的A到I剪辑，并推广了剪辑范围。

在RtABE系统中，效应模块（ADAR2DD）在伙同靶位点之前保捏失活现象，因为它与扼制剂（A3DADI）会通。eagRNA的AS区域不错伙同靶转录本，而eagRNA中的MS2和BoxB aptamers不错分裂招募失活的ADAR2DD和TEVc。eagRNA招募的TEVc与目田扩散的TEVn相互作用，从头组成完竣的TEVp，并随后切割A3DADI以在靶位点激活ADAR2DD，完了高效的A到I剪辑。为了考据这一模子，作家将RtABE系统与无eagRNA或eGFP靶向eagRNA共转染，发现浮泛eagRNA或存在eGFP靶向eagRNA时，A3DADI并未被骨子切割。此外，通过siRNA敲低内源性靶转录本（CTNNB1）后，A3DADI未被权臣切割，而当内源性靶转录本平淡抒发时，A3DADI被光显切割。因此，RtABE常常在伙同靶RNA转录本之前保捏失活现象，并在靶位点调节为活性现象，雷同于作家近期的DNA碱基剪辑洽商。

与通过异位抒发工程化ADARs的已发表RNA剪辑系统比拟，后者会激发权臣的非靶向剪辑，RtABE_V2责罚的东谈主细胞中未检测到光显的非靶向剪辑事件。值得珍藏的是，两只打针高滴度抒发MCP–ADAR2DD(E488Q) RNA剪辑系统的AAV的小鼠在打针后3至4周示寂，其原因尚待进一步洽商。与细胞系中的收尾一致，即使在低滴度下，打针抒发MCP–ADAR2DD(E488Q)的AAV的小鼠肝脏中也检测到高水平的转录组范围非靶向剪辑。比拟之下，RtABE_V2在小鼠肝脏中未激发权臣的非靶向剪辑。因此，与使用异位抒发工程化ADARs的已发表RNA剪辑系统比拟，RtABE具有更好的安全性。

与通过招募内源性ADARs的RNA剪辑政策比拟，RtABE在夙昔难以剪辑的位点（举例GAN）诱导了光显的A到I剪辑服从。此外，eagRNA的瞎想相对简便。作家提出构建几个AS区域长度为20至30个核苷酸且靶向A位于AS区域中间的eagRNA。在疾病颐养布景下，RtABE在矫正W392X突变方面进展出平均27%（范围11%至45%）的剪辑频率（打针后4周）和平均18%（范围18%至19%）的剪辑频率（打针后8周）。值得珍藏的是，过早的W392X拒绝密码子可能触发mIdua mRNA的无义介导衰变（NMD），因此，规复这一过早拒绝密码子的A到I剪辑不错幸免NMD效应，最终可能增多统统A到I剪辑产量。最近，LEAPER 2.0被报谈通过AAV寄递在非东谈主灵长类动物肝脏和小鼠核心神经系统中诱导约30%至50%的A到I剪辑服从。此外，除了遗传编码的gRNA外，化学修饰的寡核苷酸也被用于招募内源性ADARs，在非东谈主灵长类动物肝脏中诱导高达50%的高效剪辑，并显败露有但愿的临床收尾。RtABE是否能在非东谈主灵长类动物中诱导高效RNA剪辑尚待进一步洽商。

尽管具有上述优点，但RtABE仍存在需要克服的局限性。率先，RtABE通盘系统比已发表的RNA碱基剪辑器更复杂、更大，因此RtABE必须使用迷你CMV开动子能力包装到单个AAV中。因此，将包含组织特异性开动子（常常比迷你CMV开动子更大）的RtABE系统包装到AAV中是一个挑战。其次，RtABE系统仍包含一些非东谈主类因素（举例分裂的TEVp和MCP），这些因素可能在RNA剪辑需要恒久抒发的情况下激发免疫原性。此外，RtABE确刻下版块在某些靶位点的剪辑服从相对低于通过异位抒发工程化ADARs的RNA剪辑系统。此外，本洽商顶用于总共RNA剪辑系统的gRNA抒发质粒（包括RtABE系统、通过招募内源性ADARs的系统和通过异位抒发工程化ADARs的系统）包含一个嘌呤霉素抗性基因，并通过嘌呤霉素选用最大化细胞转染服从，然后索求RNA进行剪辑分析，这不错增多细胞执行中的剪辑水平。通过化学修饰eagRNA以增强其矜重性，可能会进一步进步RtABE的剪辑服从。

意旨的是，作家还尝试将A3DADI会通到RNA胞嘧啶碱基剪辑器（RESCUE）上，发现A3DADI也不错扼制RESCUE的剪辑服从。因此，雷同于RtABE的政策概况也可用于裁减C到U RNA碱基剪辑器的非靶向效应，值得进一步洽商。

总之，RtABE是一种具有庸碌适用范围的特异且高效的RNA剪辑系统。RtABE可用于矫正致病性G到A突变或规复因过早拒绝密码子而中断的卵白质翻译，在基础洽商以及畴昔的临床疾病颐养中具有潜在应用价值。

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